本方法以L-赖氨酸和L-蛋氨酸为例，对饲料等样品中十几种氨基酸的测定方法做一简要介绍。

一、方法原理

对氨基酸进行柱前衍生后，在254nm波长下，以保留时间定性，采用外标法分析时，需做标准曲线，无需加入正亮氨酸内标物。

二、所需仪器和试剂

仪器：

a.高效液相色谱仪含紫外检测器

（上海仪电分析仪器有限公司LC220）；

b. 蒸发回流装置；

c.万分之一天平；

d.恒温水浴锅；

e.实验室常用玻璃仪器。

试剂：

a.L-赖氨酸和L-蛋氨酸标准品；

b.甲醇（色谱纯）；

c.乙腈（色谱纯）；

d.醋酸钠（分析纯）；

e.乙酸（分析纯）；

f.正己烷（色谱纯）；

g.盐酸（分析纯）；

h.苯酚（分析纯）。

三、实验方法

1.色谱条件

2.试剂配制

2.1 样品前处理溶液的配制

6mol/L的盐酸溶液：将盐酸溶液（36%-38%）与超纯水等体积混合，混匀；

0.1mol/L的盐酸溶液：取8.3mL盐酸溶液（36%-38%），用水定容到1000mL的容量瓶中，混匀；

0.1%苯酚的6mol/L的盐酸溶液：移取20μL苯酚，加入20mL6mol/L盐酸溶液中，混匀。

2.2 混合标准品溶液的配制

准确称量赖氨酸、蛋氨酸标准标准品配制成2.5μmol/mL的赖氨酸、蛋氨酸标准溶液，用0.1mol/L的盐酸溶液稀释成2.5、1.25、0.5、0.25、0.125μmol/mL系列浓度绘制标准曲线，4℃冷藏保存。

2.3 衍生试剂的配制

三乙胺溶液：准确吸取1.4mL三乙胺至10mL容量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得；

异硫氰酸苯酯溶液：准确移取250μL异硫氰酸苯酯至10mL容量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得。

3.样品处理

3.1 前处理

准确称取0.1000g样品于50mL圆底烧瓶中，加入10mL0.1%苯酚溶液溶解，110℃条件下加热回流24h，反应完成后，冷却，转移到100mL容量瓶中，定容。量取50mL溶液蒸干，用水定容至2mL，待衍生。

3.2 衍生反应

准确量取水解后溶液及氨基酸标准品0.2mL，分别置于1.5mL离心管中（内标法需往每支离心管中准确加入正亮氨酸内标50μL），然后分别加入三乙胺乙腈溶液0.1mL和异硫氰酸苯酯乙腈溶液0.1mL，摇匀室温静置衍生1小时。衍生结束后分别加入0.4mL正己烷，密封后剧烈振荡5~10s，静置分层，取0.2mL下层溶液和0.8mL水混合，过0.45μm有机系针式过滤器，待上机分析。

四、实验结果

1.标样谱图

2.样品谱图

3.标准曲线

蛋氨酸标准曲线

y=289746.8125x-8752.5，R=0.9996

赖氨酸标准曲线

y=478883.6875x-426.25，R=0.9998

4.结果计算

备注：